安捷伦Seahorse XF Hu T细胞活化测定常见问题及解答

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糖酵解活性快速增加是T细胞活化的早期标志性事件,并且是后续T细胞增殖和分化所必需的。安捷伦Seahorse XF Hu T细胞活化测定可监测活化剂诱导的糖酵解反应来测量T细胞活化。利用XF平台,测量质子释放率(PER)来评估细胞糖酵解活性,这种快速的分析方法为T细胞活化检测提供了一个早期窗口。

安捷伦 Seahorse XF Hu T 细胞活化测定曲线

Seahorse XF Hu T细胞活化测定实验支持两种实验设计:标准实验用于检测T细胞活化,调节实验用于研究调节剂的急性效应。

安捷伦Seahorse XF Hu T细胞活化测定常见问题及解答

安捷伦Seahorse XF Hu T细胞活化测定试剂盒可用于非人T细胞吗?

不能,该检测试剂盒仅适用于人原代T细胞或人T细胞系。

XF Hu T细胞活化测定试剂盒附带的活化剂是什么?

ImmunoCultCD3/CD28 T细胞活化剂 (STEMCELL Technologies, Inc.),不含牛血清白蛋白(BSA)ImmunoCultCD3/CD28 T细胞活化剂是一种四聚体抗体偶联物,其可以结合CD3CD28细胞表面配体并刺激T细胞活化。它是一种即用型试剂,与Seahorse XF探针板上专门设计的加药口兼容,可缩短分析的准备时间,提高分析可靠性。

可以使用不同类型的分析培养基进行XF Hu T细胞活化测定吗?

已使用补充10 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸和2 mmol/L谷氨酰胺(货号分别为103577-100103578-100103579-100)的XF RPMI 培养基(pH7.4,货号103576-100)对XF Hu T细胞活化测定进行了验证和优化。如果使用其他类型的培养基或改变补充剂浓度,则可能会改变PER响应,并且可能需要进行活化剂滴定分析。

需要进行细胞接种密度优化实验吗?如何进行?

需要。首次进行XF Hu T细胞活化测定时,建议进行相应实验(例如,使用显微镜对单层细胞进行评估)以优化细胞接种密度。试剂盒说明书中建议的接种密度仅作为参考,应该使用多个高于及低于推荐数量的接种密度进行优化实验。因为不同用户或不同实验室使用的细胞计数方法不同,可能产生不同的计数结果,导致XF细胞培养微孔板上的接种密度不理想。如果细胞密度低于最佳值,则可能会降低活化信号水平或产生无法解析的数据。相反,如果孔中细胞过多,一些细胞不能附着在孔底部,在加入活化剂时会被冲到一边,导致分析结果的孔间差异较大。一般来说,离心后,细胞应以单层形式均匀分布在孔板底部,细胞之间有一定的空隙。离心步骤后,最佳细胞密度应显示类似于图A的细胞分布或略高,并且不应超过图B所示的密度。

最佳细胞接种密度示例的微观视图:(A) 图显示最佳细胞密度下限;(B) 图显示最佳接种密度上限。

每种条件下推荐进行多少次测量,可以改变分析的时长吗?

通常,在第一次加入试剂之前建议进行3次基础测量以获得可靠的基础速率,在加入2-DG并等待6分钟后,建议进行4次测量。加入T细胞活化剂后的测量持续时间通常为1小时或10次测量,也可以根据实验需要延长至3小时。根据实验需要,加入调节剂后的测量持续时间从30分钟到1小时不等。

使用XF Hu T细胞活化测定试剂盒测定T细胞活化潜力时,预期结果是什么? T细胞活化潜力由基础 PER信号和最大PER信号决定,并且根据细胞类型不同而不同。下表提供了不同T细胞类型的典型PER水平汇总,以供参考。其他因素也可能影响T细胞活化潜力,如供体、收集过程中细胞的处理方式以及储存条件 (见下一个问题)。

不同类型T细胞的典型质子释放率 (PER)

如果细胞没有反应,该怎么办?

根据供体、收集期间细胞的处理方式以及储存条件的不同,活化潜力也会不同。建议使用反应性细胞作为阳性对照以确保分析正常进行。如果阳性对照显示出良好的反应,但测试细胞未显示任何反应,建议重新查看细胞收集程序或储存条件。可以使用正交功能方法(如细胞因子生成)确认细胞的活化潜力。

无法访问安捷伦Seahorse Analytics,该做些什么?

如果使用Seahorse Analytics时遇到任何问题,请联系安捷伦细胞分析支持团队报告您的问题。同时请仔细检查您的网络连接。为了排除与网络浏览器相关的任何问题,建议使用ChromeSafariFirefoxEdge运行Seahorse Analytics。对于使用Seahorse Analytics进行数据分析时遇到的任何其他问题,您可以将数据导出到Microsoft ExcelGraphPad Prism,以量化最大响应和曲线下面积数据并绘图。有关如何计算分析参数的更多信息,请参阅安捷伦应用简报:使用 Seahorse XFe96分析仪通过实时测量糖酵解来调节和检测人T细胞活化。

声明:仅供研究使用,不用于诊断性操作。

版权说明:版权归原作者及安捷伦细胞团队,本文内容部分来源于美国安捷伦科技公司官网(www.agilent.com)。如有问题请联系小编,欢迎批评指正,衷心感谢!

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2021年1月14日 11:00
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